過(guò)氧化物酶(POD)活性檢測(cè)試劑盒規(guī)格:50T/48S
注意:正式測(cè)定之前選擇2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
產(chǎn)品內(nèi)容:
提取液:液體 60mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:液體 60mL×1 瓶,4℃保存;
試劑二:液體 0.33mL×2 瓶,4℃保存;用時(shí)每瓶加入5mL 試劑一;用不完的試劑4℃保存一周;
試劑三:液體 10 mL×1 瓶,4℃保存。
產(chǎn)品說(shuō)明:
POD(EC 1.11.1.7)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,可催化過(guò)氧化氫氧化酚類(lèi)和胺類(lèi)化合物,具有消除過(guò)氧化氫和酚類(lèi)、胺類(lèi)毒性的雙重作用。POD 催化 H2O2 氧化特定底物, 在470nm有特征光吸收。
需自備的儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水
過(guò)氧化物酶(POD)活性檢測(cè)試劑盒操作步驟:
一、粗酶液提取:
1、 細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱(chēng)取約 0.1g 組織,加入
1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、 血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。二、測(cè)定步驟:
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至470nm,蒸餾水調(diào)零。
2、測(cè)定前將試劑一、二和三 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)放置10min。
3、樣本測(cè)定表
試劑名稱(chēng)(µL)測(cè)定管
樣本15
蒸餾水270
試劑一520
試劑二130
試劑三135
在1mL玻璃比色皿中按順序加入上述試劑,立即混勻并計(jì)時(shí),記錄470nm下30s 時(shí)的吸光值
A1和1min30s后的吸光值A(chǔ)2。計(jì)算ΔA=A2-A1。
注意:
a.若一次性測(cè)定樣本較多,可將試劑一、二、三和蒸餾水按比例配成混合液,在 37℃(哺乳動(dòng)物) 或 25℃(其它物種)放置10min 以上,測(cè)定時(shí)加入15µL 樣本和1055µL 混合液測(cè)定。
b.如果ΔA 小于0.005,可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到5min。如果ΔA 大于0.5,可將樣本用提取液稀釋后測(cè)定,計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
三、POD 活性計(jì)算:
1、 血清(漿)POD 活性
單位定義:每mL血清(漿)在每mL 反應(yīng)體系中每分鐘A470 變化0.01 為一個(gè)酶活力單位。計(jì)算公式:POD(U/mL)=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T =7133×ΔA
2、 組織、細(xì)菌或細(xì)胞 POD 活性
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。
POD(U/mg prot)=ΔA×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位。
POD(U/g鮮重)=ΔA×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
單位定義:每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化0.01為一個(gè)酶活力單位。
POD(U/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V 樣總)÷0.01÷T=14.27×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,1.07mL;V樣:加入樣本體積,0.015mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。